FAIR_bioinfo

Thomas Denecker & Claire Toffano-Nioche

Session 3

22/02/2019

Session 3

Jouer avec les outils d'analyse

Le projet

Analyse d'expression différentielle de gènes à partir de données RNAseq

Programme session 3

  • Présentation des outils du workflow (FastQC, Bowtie2, Samtools, HTseq-Count)
  • Installation de FastQC à la main
  • Présentation de conda
  • Script pour l'installation de FastQC avec conda
  • Amélioration du script d'installation : ajout des autres outils (travail à la maison)
  • Amélioration du script d'analyse : workflow d'analyse à faire en boucle pour chaque échantillon (à faire tourner à la maison)

Les données

Etude du métabolisme du fer chez O. tauri

Origine des données 

Organisme : Ostreococcus tauri

 

Type de données : RNAseq single end

 

Publication : 10.1186/s12864-016-2666-6

Plan d'expérience 

Répliques biologiques : 3

Conditions expérimentales différentes : 16

Etude de la différence +Fe / -Fe à 9h en lumière condition 1

Plan d'expérience 

Répliques biologiques : 3

Conditions expérimentales différentes : 16

Etude de la différence +Fe / -Fe à 9h en lumière condition 2

Où sont les données?  

47 fichiers d'expériences

Le workflow

Présentation du workflow d'analyse

Le choix des outils utilisés et des paramètres associés dépendent de la technologie de séquençage, de l'organisme étudié et de la question scientifique posée

  • Technologie de séquençage : illumina, single-end
  • Organisme : algue O. tauri => introns, de taille ~140 bp
  • Question : analyse différentielle d'expression de gènes

Worflow d'analyse

Reads (fastq)

Génome de référence

Annotations du génome

FASTQC

Bowtie2

SAMtools

IGV

DEseq2

HTSeq

Worflow d'analyse

Reads (fastq)

Génome de référence

Annotations du génome

FASTQC

Bowtie2

SAMtools

IGV

DEseq2

HTSeq

Analyse qualité, FastQC

Reads (fastq)

FASTQC

@SRR3099585.1 HWI-ST365:427:H8K2HADXX:1:1101:1497:2215/1
CTCCCTTGACATCTCGATGTCCTTGGTGAGCTCGTCAACCGCGTCCGCACGATACATTTGGTATGTCTTGAATACCTTCGGGAATCGTTGACGATCTGGA
+
@@@DADDD8:CFH9E3:?AC?BF>AC<+C+<E?:8C?FEE0?D0@:'--;A?B;>>3(6;@B>5;5B@@A@:3>A#########################
@SRR3099585.2 HWI-ST365:427:H8K2HADXX:1:1101:1653:2087/1
GTCGACGAATATAAAGTTATTGGGAGAGACGCTGAAGGTCGCGTTGGAGATGGACTCAATTGCGCTTCGCGTTCGCCTCGTGGGTGTTCGCCCGGCTCAC
+
@CBFFFFFHHGHHJJJHHJJJJJJJJJIJJJJJJIJJJGHJJJJJJHHHHHFFFFFEEEEEEDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDBDDDDDDDDDDDDDDD
@SRR3099585.3 HWI-ST365:427:H8K2HADXX:1:1101:1554:2142/1
CGACTCAATAACCTTGTCTTCGATCGGCGGCACGGAGCCAGTGATATCGCATTCGCCGGGGAACCACTCGAGCTCAGTCATCCGAGAGCGCAAGGGCGCT
...

Objectif : Réalisation d'un contrôle qualité des reads :

- histogramme de qualité selon la position des bases

- la taille des reads

- beaucoup d'autres critères

Rapport (html)

Analyse qualité, FastQC

Rapport html : à regarder avec un navigateur

 

Nécessite une inspection manuelle

 

Pas de décision automatisée

Bonne

qualité

Qualité

moyenne

Mauvaise qualité

Analyse qualité, FastQC

Mauvaise qualité ?

Le plus souvent, il faut agir pour modifier les reads. Par exemple :

- supprimer les 20 dernières bases (trimmer) 

- Retirer les adaptateurs (cutadapt)

Que faire si la qualité n'est pas bonne ?

Analyse qualité, FastQC

6 fichiers de reads

 

 

6 FastQC

Un des fastQC du projet

6x

Worflow d'analyse

Reads (fastq)

Génome de référence

Annotations du génome

FASTQC

Bowtie2

SAMtools

IGV

DEseq2

HTSeq

Mapping, bowtie2

Reads (fastq)

Bowtie2

Génome de référence (fasta)

@SRR3099585.1 HWI-ST365:427:H8K2HADXX:1:1101:1497:2215/1
CTCCCTTGACATCTCGATGTCCTTGGTGAGCTCGTCAACCGCGTCCGCACGATACATTTGGTATGTCTTGAATACCTTCGGGAATCGTTGACGATCTGGA
+
@@@DADDD8:CFH9E3:?AC?BF>AC<+C+<E?:8C?FEE0?D0@:'--;A?B;>>3(6;@B>5;5B@@A@:3>A#########################
@SRR3099585.2 HWI-ST365:427:H8K2HADXX:1:1101:1653:2087/1
GTCGACGAATATAAAGTTATTGGGAGAGACGCTGAAGGTCGCGTTGGAGATGGACTCAATTGCGCTTCGCGTTCGCCTCGTGGGTGTTCGCCCGGCTCAC
+
@CBFFFFFHHGHHJJJHHJJJJJJJJJIJJJJJJIJJJGHJJJJJJHHHHHFFFFFEEEEEEDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDBDDDDDDDDDDDDDDD
@SRR3099585.3 HWI-ST365:427:H8K2HADXX:1:1101:1554:2142/1
CGACTCAATAACCTTGTCTTCGATCGGCGGCACGGAGCCAGTGATATCGCATTCGCCGGGGAACCACTCGAGCTCAGTCATCCGAGAGCGCAAGGGCGCT
+
@@<DDDD;DHF8?<CHG+AE<CBH??)@D:@8A';B'5?7..).;>@C1??@3>5;8'5&05<(8<899889@@CCA@C#####################
@SRR3099585.4 HWI-ST365:427:H8K2HADXX:1:1101:1598:2160/1
CCAGCCTCTCGCGACGACGGCGGCGTGGGAGGTCATGCCGCCGCGCGCGGTGAGGATGCCCTCAGCGGCGTCCATGCCGCCGACATCTTCTGGAGACGTC
+
@@@DDDBDFF@D@AGHIFI>>FA9?D;?@A@B?<C>8@A966<BB9978B8B<?BCDCDCDCBACC58;909>BEDD@5@@B55<@DCDEDDDDBAB@<<
@SRR3099585.5 HWI-ST365:427:H8K2HADXX:1:1101:1955:2129/1
CCCGGCGTGAAAATCAGTCGTCCAAACAGTGGCGCGCCTCTGTAGCGCCCGTGCCTCGAGGTCATACACGCTCGTAGAGTTGAAATCACTCGTCTTTGTC
+
?@?ADDDDHHDFH>FH?2CF?CDGIIIH@BBBD6DFAHGIICFH?><BDCC9;?AA5;=@B7?@CDCCC?BBB;>B<?C:>AACCCCAC@@@<?<@C>4>
@SRR3099585.6 HWI-ST365:427:H8K2HADXX:1:1101:2198:2175/1
CCTCGAGCACCAAAATCATCCCGCTGTCCTGGAGCAATTGCAACTTCTCCGCAGTCTCCGCCGGTGATCTCGGCGGGGGGGCGGCGGTGCGCACGAGCTC
+

Objectif : localisation des reads sur le génome de référence

>NC_014426.2 Ostreococcus tauri WGS project CAID00000000 data, contig chromosome 01, whole genome shotgun sequence
ccctaaaccctaaaccctaaaccctaaaccctaaaccctaaaccctaaaccctaaaccctaaaccctaaaccctaaaccc
taaaccctaaaccctaaaccctaaaccctaaaccctaaaccctaaaccctaaaccctaaacgaTGCATTACTACTCACAC
GAACGAGTGAATGAAACACACGAAACACAACTATCTGCATGGGAATGCGATGCTTTCTGACGATATGTTACACGATTCGA
GTGTCATCGTCTTTTCAATGACGCTTGCGCTCCGAAaatgctcgcgcgctgagcTACGGACCCTGTTTTGTATTCGACAT
CATCATCCGTTTTTATCGGCGCCGAGCCCTCAAAAacagccgcgcgcgctgtgaTGCTCGGAGAGATATTTTCACCCTTC
GGCAAAGACACTGGGCTCTCGCGTTTGACGAGTTCGGGCTCTCGCATTGCCGCTGTCGCTCCATCTATTTTCACCCTGGT
CGGCTGCGACGGTTTTACGATCGTTACCGCTTGCGGTCTCTCCACGTCGGCTAAATCATccaagtcgtcgtcgatatCGC
TTTCCTCCTCGACCGAGCGATTCCGCCGCGCCACGGCGGCTGCCCACGCATCGTTTGTTTCAACTTCATACGGCGTAACA
GCAGTGACCAACGGTATCGCCGCTGATGGCGGCGTTATAACCTTCTGTGCCGCAGCACGGACGACCGGTGCGCACGCGAC
AGGCTCTTTCACaaccggcggcggcatTTGCGACGCTTTCTTAATCGCGTCCGACTCCCTCGCTTTGAAAACGTTTGACG
CGACTGAAATTGCAGTCGGAACTTCAACATTTGCCTCGTGGTGCGATGAGACATTCGACTGCGAACGAGCCGACGCAGAA
GAGAAGAAATCCGTCTTCGGCGTTAATGACACATCCGCCCCTTTAGCTGATTCTGATTCTGTCACGATTGGTTCAACCTC
TAGGGGAAGATTTGGCACATTAGTCAGCTCTGGATTGTGCGTCGCGTTTTCGTTCAATACGCGCTCGGCTTCGTCAGCGC
TCACACCCGTtagacgctcgagctcggcgagctgTTTGCGAAGCGCCTCCATCTCATCCGCTGTTCCAGCCTCGCCACTC
GAGTCGTTTGTGGACGGAAGCGCATTTCGTTTCAcattcgcgacgccgccctcgAGTACATTTCCTACAAATCGCACTTC
GCGTTCAAAATTTTCTTCGTCGAGGAACTCCTCCTCAAACACTGAAGCTCGCGCgggtcgaggcgctcgctcggTCTCGA
SRR3099585.16   16      NC_014443.2     249781  42      100M    *       0       0       TCCCGCGTCTGGAAAGCCGCGCGATGAGATCCTCGAGGAGGTTGGAGCGATGCTCGATAAGTTTGACGACGTCATGAGTGCGGAAGAGAACGACGATGAG    >B>@DDDDDEDDCBDDBD@<BCCACCDDDDDDDDDDDEC>C@CBFHA:GHIGGEAGHEIIIGIGIIIHDJJIJJJJGIIJHHGHEIHHHHGHFFFFFBBB AS:i:0  XN:i:0  XM:i:0  XO:i:0  XG:i:0  NM:i:0  MD:Z:100        YT:Z:UU
SRR3099585.17   0       NC_014427.2     503521  42      100M    *       0       0       AGCATACGCTGCTGGAGCCGGAAGTTGAGCTGCGGCGTCATCACGCCACTTTCCATCGTACTCTTATACTCCTTCTGAAGCTCTTCGATCTGTTTTTGCA    @;?DDDDDH?1<AA<C;>FE1?EHHIDGFGFB@F<?'-@=?C=?BD?>ACCCCCDCABB<9?CA>ACCCCC>CCCA(4::CCC>CCB@>@@@::>9?0>@ AS:i:0  XN:i:0  XM:i:0  XO:i:0  XG:i:0  NM:i:0  MD:Z:100        YT:Z:UU
SRR3099585.18   16      NC_014431.2     518181  42      100M    *       0       0       TCCATCCGTTTTCGGAGGTAAATTCATAGGCGAAGTTATGCCAGCCCGCGATACGGAGCGATGTACACTAGCCCGCTCCGCGTTGAATGTACCAGTAGCG    CB@<8?BC>CBBB?@A@DCCDDAACC>9>5<@DCCC@CCBB<BB<8BBCCCBCCABEDFE@HE=??CED>HFFIGF:GCGHIBGGIGBHF<HFFDFFC@@ AS:i:0  XN:i:0  XM:i:0  XO:i:0  XG:i:0  NM:i:0  MD:Z:100        YT:Z:UU
SRR3099585.19   0       NC_014427.2     236213  42      100M    *       0       0       GCCCATTTCTTCGCGCTTCTTCTTACCGCGCAAGTGAGTCCCAAGCTGCAACAGACAAATAAAACAAGCGTCGTCAGTCGAATGTATTTTGGATCATTCC    BCCFFFFFHHHHHJJJJJJJJJJJJJJJIJJJJJHIJJJJJJHIIJJJJJHHHHHFFFFFEEEEEDDDDDBDDDDDDDDDDDDDDEEEEEDDDDDDDEEE AS:i:0  XN:i:0  XM:i:0  XO:i:0  XG:i:0  NM:i:0  MD:Z:100        YT:Z:UU

localisation (sam)

Mapping, bowtie2

SRR3099585.16   16      NC_014443.2     249781  42      100M    *       0       0       TCCCGCGTCTGGAAAGCCGCGCGATGAGATCCTCGAGGAGGTTGGAGCGATGCTCGATAAGTTTGACGACGTCATGAGTGCGGAAGAGAACGACGATGAG    >B>@DDDDDEDDCBDDBD@<BCCACCDDDDDDDDDDDEC>C@CBFHA:GHIGGEAGHEIIIGIGIIIHDJJIJJJJGIIJHHGHEIHHHHGHFFFFFBBB AS:i:0  XN:i:0  XM:i:0  XO:i:0  XG:i:0  NM:i:0  MD:Z:100        YT:Z:UU
SRR3099585.17   0       NC_014427.2     503521  42      100M    *       0       0       AGCATACGCTGCTGGAGCCGGAAGTTGAGCTGCGGCGTCATCACGCCACTTTCCATCGTACTCTTATACTCCTTCTGAAGCTCTTCGATCTGTTTTTGCA    @;?DDDDDH?1<AA<C;>FE1?EHHIDGFGFB@F<?'-@=?C=?BD?>ACCCCCDCABB<9?CA>ACCCCC>CCCA(4::CCC>CCB@>@@@::>9?0>@ AS:i:0  XN:i:0  XM:i:0  XO:i:0  XG:i:0  NM:i:0  MD:Z:100        YT:Z:UU
SRR3099585.18   16      NC_014431.2     518181  42      100M    *       0       0       TCCATCCGTTTTCGGAGGTAAATTCATAGGCGAAGTTATGCCAGCCCGCGATACGGAGCGATGTACACTAGCCCGCTCCGCGTTGAATGTACCAGTAGCG    CB@<8?BC>CBBB?@A@DCCDDAACC>9>5<@DCCC@CCBB<BB<8BBCCCBCCABEDFE@HE=??CED>HFFIGF:GCGHIBGGIGBHF<HFFDFFC@@ AS:i:0  XN:i:0  XM:i:0  XO:i:0  XG:i:0  NM:i:0  MD:Z:100        YT:Z:UU
SRR3099585.19   0       NC_014427.2     236213  42      100M    *       0       0       GCCCATTTCTTCGCGCTTCTTCTTACCGCGCAAGTGAGTCCCAAGCTGCAACAGACAAATAAAACAAGCGTCGTCAGTCGAATGTATTTTGGATCATTCC    BCCFFFFFHHHHHJJJJJJJJJJJJJJJIJJJJJHIJJJJJJHIIJJJJJHHHHHFFFFFEEEEEDDDDDBDDDDDDDDDDDDDDEEEEEDDDDDDDEEE AS:i:0  XN:i:0  XM:i:0  XO:i:0  XG:i:0  NM:i:0  MD:Z:100        YT:Z:UU

Format texte avec des colonnes : 

  • Nom du read (colonne 1 : SRR3099585.18 )
  • Position de chaque read sur le génome (colonne 4 : 518181)
  • CIGAR (Concise Idiosyncratic Gapped Alignment Report ) (colonne 6 : 100M)
  • ...

6 fichiers de reads                 6 sam

Fichier de sortie : .sam (Sequence Alignment Map)

6x

Colonnes du fichier SAM

Col Field Type Brief Description
1 QNAME String Query template NAME
2 FLAG Int bitwise FLAG
3 RNAME String References sequence NAME
4 POS Int 1- based leftmost mapping POSition
5 MAPQ Int MAPping Quality
6 CIGAR String CIGAR String
7 RNEXT String Ref. name of the mate/next read
8 PNEXT Int Position of the mate/next read
9 TLEN Int observed Template LENgth
10 SEQ String segment SEQuence
11 QUAL String ASCII of Phred-scaled base QUALity+33

CIGAR

Compact Idiosyncratic Gapped Alignment Report

Chaîne de caractères qui indique de façon synthétique l'alignement du read sur le génome de référence.

M Match/Mismatch Exact match or mismatch of x positions
N Alignment gap Next x positions on ref don’t match
D Deletion Next x positions on ref don’t match
I Insertion Next x positions on query don’t match 
0123456789
AAGTCTAGAA (ref) 
  GTGTAG   (query)
0123456789
AAGTC  TAGAA (ref) 
  GTCGATAG   (query)

CIGAR : 5M

CIGAR : 3M2I3M

Worflow d'analyse

Reads (fastq)

Génome de référence

Annotations du génome

FASTQC

Bowtie2

SAMtools

IGV

DEseq2

HTSeq

Traitements des mappings, SAMtools

Bowtie2

SAMtools

   1- Conversion SAM en BAM

(+/- sélection de reads)

   2- Tri et index

SAM

   BAM (binary align map)

   BAI (BAM index)

6 fois

Traitements des mappings, SAMtools

1- Conversion SAM en BAM

SRR3099585.1    0       NC_014429.2     517050  42      100M    *       0       0       CTCCCTTGACATCTCGATGTCCTTGGTGAGCTCGTCAACCGCGTCCGCACGATACATTTGGTATGTCTTGAATACCTTCGGGAATCGTTGACGATCTGGA    @@@DADDD8:CFH9E3:?AC?BF>AC<+C+<E?:8C?FEE0?D0@:'--;A?B;>>3(6;@B>5;5B@@A@:3>A######################### AS:i:-6 XN:i:0  XM:i:3  XO:i:0  XG:i:0  NM:i:3  MD:Z:76G5T5G11  YT:Z:UU
SRR3099585.2    0       NC_014431.2     29281   42      100M    *       0       0       GTCGACGAATATAAAGTTATTGGGAGAGACGCTGAAGGTCGCGTTGGAGATGGACTCAATTGCGCTTCGCGTTCGCCTCGTGGGTGTTCGCCCGGCTCAC    @CBFFFFFHHGHHJJJHHJJJJJJJJJIJJJJJJIJJJGHJJJJJJHHHHHFFFFFEEEEEEDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDBDDDDDDDDDDDDDDD AS:i:-5 XN:i:0  XM:i:1  XO:i:0  XG:i:0  NM:i:1  MD:Z:46A53      YT:Z:UU
SRR3099585.3    16      NC_014440.2     89634   40      100M    *       0       0       AGCGCCCTTGCGCTCTCGGATGACTGAGCTCGAGTGGTTCCCCGGCGAATGCGATATCACTGGCTCCGTGCCGCCGATCGAAGACAAGGTTATTGAGTCG    #####################C@ACC@@988998<8(<50&5'8;5>3@??1C@>;.)..7?5'B;'A8@:D@)??HBC<EA+GHC<?8FHD;DDDD<@@ AS:i:-14        XN:i:0  XM:i:5  XO:i:0  XG:i:0  NM:i:5  MD:Z:36C3T17T4G35T0     YT:Z:UU
SRR3099585.4    16      NC_014427.2     869647  42      100M    *       0       0       GACGTCTCCAGAAGATGTCGGCGGCATGGACGCCGCTGAGGGCATCCTCACCGCGCGCGGCGGCATGACCTCCCACGCCGCCGTCGTCGCGAGAGGCTGG    <<@BABDDDDEDCD@<55B@@5@DDEB>909;85CCABCDCDCDCB?<B8B8799BB<669A@8>C<?B@A@?;D?9AF>>IFIHGA@D@FFDBDDD@@@ AS:i:0  XN:i:0  XM:i:0  XO:i:0  XG:i:0  NM:i:0  MD:Z:100        YT:Z:UU
SRR3099585.5    0       NC_014444.2     80679   42      100M    *       0       0       CCCGGCGTGAAAATCAGTCGTCCAAACAGTGGCGCGCCTCTGTAGCGCCCGTGCCTCGAGGTCATACACGCTCGTAGAGTTGAAATCACTCGTCTTTGTC    ?@?ADDDDHHDFH>FH?2CF?CDGIIIH@BBBD6DFAHGIICFH?><BDCC9;?AA5;=@B7?@CDCCC?BBB;>B<?C:>AACCCCAC@@@<?<@C>4> AS:i:0  XN:i:0  XM:i:0  XO:i:0  XG:i:0  NM:i:0  MD:Z:100        YT:Z:UU
SRR3099585.6    16      NC_014435.2     136707  42      100M    *       0       0       GAGCTCGTGCGCACCGCCGCCCCCCCGCCGAGATCACCGGCGGAGACTGCGGAGAAGTTGCAATTGCTCCAGGACAGCGGGATGATTTTGGTGCTCGAGG    ######################D@DDDDDDDDC?B@DDFFHGHDIIIHGJJHJJJJIJJIGIGJIGCCIIGIIHJJIGHJIIJJIJIHHFFHFDDDD?== AS:i:-8 XN:i:0  XM:i:4  XO:i:0  XG:i:0  NM:i:4  MD:Z:13A1A0G4T78        YT:Z:UU
SRR3099585.7    4       *       0       0       *       *       0       0       CATCGCTCGTCTTCGCCCGGTCGCTCATCCTCTAGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACATTCCTTTATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTGA    ???BDFDDD:DFAHEH>H<CGBFGHGIFGBGFGCCHCHD;@CGDHHEECAD??AA:@>@AC55555>3;AC@CCCCC@A588<C9>:55<ABCCCAAC>A YT:Z:UU
SRR3099585.8    16      NC_014432.2     405245  42      100M    *       0       0       TAACGCCAATTAGCACGAATTCGTTTAGTCTCGTTTAGTCGCGGGAGATGAGTTTACGCTAAGAGCGTATGGTTCTGCAGTAAACACGTGTTGTACCACC    DB>BAACDCDCB@BDDDDB?BBCDDDDD?6?DDDCDDDFEEGGIJIJIIIIIJIHEGJJJIHGGGFJIJJIIHGIIIGEIIHBJIJJHHFGGEDDFFC@@ AS:i:0  XN:i:0  XM:i:0  XO:i:0  XG:i:0  NM:i:0  MD:Z:100        YT:Z:UU
SRR3099585.9    16      NC_014439.2     176178  42      100M    *       0       0       CCTCACGAAGAAGGCTGAGGAAGGCAAGCTTGACCCGTGCATCGGCCGCGTGAACGAAATCATTCGTGTCACGCAAATTCTCGGACGCCGTACCAAGAAC    DDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDBDDDDDDDDDDDDDDFFFFHHHHJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJHHHHHFFFFFCCB AS:i:0  XN:i:0  XM:i:0  XO:i:0  XG:i:0  NM:i:0  MD:Z:100        YT:Z:UU
SRR3099585.10   16      NC_014443.2     282577  42      100M    *       0       0       GGGATGGCGCGCGAATCGATCGATGCGACGATCGAAACGATCGCGCGGGCGATGACGACGACAGCGGCGAGCTCGTCGTCGACGTCGTTTTTAGGACGCG    DDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDEDDDDDDDDDDDDDDDDDDCDDDDDDDDDDDDDDFHHJJIHFJIJJJJJJIIJJJIJHHHHHFFFDD@BB AS:i:0  XN:i:0  XM:i:0  XO:i:0  XG:i:0  NM:i:0  MD:Z:100        YT:Z:UU
SRR3099585.11   16      NC_014438.2     170775  42      100M    *       0       0       ACGTGGTGTTGCATCGGTTGCTCAGAGAGTGCGAGGGCGGAGAGTTCAAGCACGAGTTTTTCAGGTTTTTGGAGTTTTTATCTCGGAAAACGCACGCGCT    DDDB?DDDDDDDDDDDDCCACDDDDDD@DDDBDBDDBDEEDEEEFFFFFHHHHIHIJJJJJJIJJJJJJJIJIJJJIHIHIIJJIHIHGHFHFDFFFC@B AS:i:-5 XN:i:0  XM:i:1  XO:i:0  XG:i:0  NM:i:1  MD:Z:99C0       YT:Z:UU
SRR3099585.12   4       *       0       0       *       *       0       0       CAAGCCGAGGCACACCGTGCTCACCGGAGCTCGGCAGAACTGCATCGCGTCGTAAATCCCCATCCCACCCGTCACAGATCGGAAGAGCACACGTCTGAAC    @@@FFDD@8C?CFACE?E??FGDC>6087?=<;8F6;;E@??CDC>?AA>338?<?55::<?CCA84+89-)28?CCC43<@<(5<83:<<A928<?CA> YT:Z:UU
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SAM

BAM

254 Mo

Binaire

(optimal pour l’ordinateur)

1 404 Mo

Lisible 

(optimal pour l'Homme)

Traitements des mappings, SAMtools

1- +/- sélection

Tous les reads ne sont pas conservés :

- Ceux qui ne s'alignent pas

- Ceux qui s'alignent à plusieurs endroits (régions répétées)

 

2- Tri et index

Indexation pour optimiser la recherche

 

Conclusion

Plus léger donc plus rapide à parcourir (pour l'ordinateur !)

BAI�IJ�KK�Lji|\ji;�!�k
                                          �<�kK�KC`LC`��N����L
                                                                                  �<�k����kM����kc�
                                                                                                      l���I���Q�F�3|e�3O��L�3M����TN��3	ʚ3R|e�3W��3PL�3�F�3WX���V	���aU	ʚ3�ؚ3SW��3N��3X	���a����aV�ؚ3X���V[|\ji;�!�kY����a�Ljikc�
                                                                                                         ly�hVwqI���c���rc���+��s+���1V��uxnV����V��v��V����V��t�1V��xnV��w��V����V��x��V��K��hjyK��hjH��hjzH��hj%��hj{%��hj(+�j|(+�j�v+�j}�v+�jo�+�j~o�+�j��+�j��+�jî+�jly�hVw�����ux]k��x]k���x]k��x]k���x]k��x]k���x]k_i�k�_i�k>i�k�>i�k[8%�n�[8%�n%K%�n�%K%�n�%�n�î+�j�+�j�����nS�o��/�oaD�o�aD�o\\�o�\\�o ��o��+�j�ux]k�u��oK��o�K��o&R�%p�&R�%p�|�%p��|�%p鑊%p�鑊%p���%p����%pcŊ%p�cŊ%pP�$��P�$�
         k�$���%�n����n�.��$����$�����$�!��$��!��$�k��$��k��$��Y���Y�1&�Y�� ��ou��o��F�Y�lZ�Y��lZ�Y��e�Y���e�Y�v��Y��[���3[����3[���b[����b���[

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‹     ÿ BC ;m“¿oÔ0Ç]…e↨{ÿxŽã›
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ȼÜ÷„¨IŽJZ«÷r=
j´n˜9ý=P³JÁó¢ØHö"ß	ÑK+ÿdýû–¨‡œljNjˆÙiñ;2°mÄêI(È#füžš¡þ®mU`ØïšóLׄɍàìêúÚ)—7ïu¹œƒr¹Z,œÅœcþÇŽ8à]äB˜yÇɤ Df\õ‚/çR“4š_«ëTÁGJ­+ç„‹‚ȧŽ¦ò“Š~±áÅßµÍDfÝjŒ¹9êS½I87+%%Çß2WÇêP'‡:÷ÔfÓ…Œ˜ïTÇ9;'s`0£}àü Ú[Ÿ™Z5T“ûPÿ‘-êé¤gX´¦˜}}:iC+êÖK
¶ªŽsu¸e&wÐu­ïÁÅ›jøÛ¢ž ª­em¿Ÿ0_òÕÍ]¥b}ð¼éF¢–û;ñì^ݹd#ÔfkÃ{cPºÁVÄÊ¿*¯}¹Å˜ªÓÇ7ô¸qÞ…:0º+þXË¿ÆËú§‚ŠÜO‚zØÁˆï‰Úhxªj»º®K¹¦ÚÚˆÂù*ÑvËñT°®æ¢½W³j³ëVHöŒ65×Åmìð§@ÝφcÓ’Õµ:µ7ÝÒðRϲšJÍÇdkiê³ók}8
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MÑI”—ªnDR¾ªÑ¤dÔÄdŽ•6>ÉhãN˜/Ÿ€ºc8Ö 3T_ÅÁ³ùv‰óû¶‘¢E–šábPÞÉæ¡ä±V	ã²6ÂÕÇÂNgë1PC’f:RN§¢NT1t_¡ô0«ŸJ&H®QÇ"‰÷ĦqR‹i¬P†»,?GJZÌsz[ÛÍ@M#)²¦/ˆYO}í„=göõZà@VG’tr‡oÔ±R4ÀèË›ØُÚí=í1cº’›¢ø+‰åÓ]J/gÊ0°}TÆBîøŠîþ”+þ0Í	t4Âv!k,&¶!à`™LIÌì1”ú•²˜éu³ºq©4$Ö ÕXV%ÿ-KßòªÎÎ|ðÙœð§lf?i8Áû“Áh¤ì„ŽípWl”µXܔ˻ŠX©I뭍¯›JM,9ôl_ÄeØf‡ú§Q'Ó‰b®™Œî}YÞˆ&
B«»r)v¸KU RnØd'qÄûa3äZ¦aýñ1P“žN!Ù£nC-j²PG”¥¡ñxB¾:IH‰ÁmŸžëÃÏ×	À²Ž!Òð
ÿàdÐÛAÃ¥n×lcmÿ´VîgÏÎΟ“ÈþLËjY/Ì–õ”®\2Gjy	Öä%@:ïFÁÙkÍqç(/â€ÂsÜE &ï6›H‰	’aqH”r‡ˆæmWf_Ñà¶a’CÒõÁM~ú܇h…˜ØÂpŸ¡›]y(Ù£Ö›™.¨Q´ªinÔÉæLOõ¨AL¥ùú# Îõîåò«ÎC:-–²Q"æŒïiz™UÕ§E-”½'ý1!Ôu;6,|ý)ÆP(þ  ‹     ÿ BC

BAM

Worflow d'analyse

Reads (fastq)

Génome de référence

Annotations du génome

FASTQC

Bowtie2

SAMtools

IGV

DEseq2

HTSeq

Visualisation 

Génome de référence

Fichier fasta

Annotations du génome

Fichier gff

IGV

Mapping des reads

Fichier bam

Fichier GFF

Fichier composé de 9 colonnes, indiquant les positions génomiques de début et de fin d’éléments génomiques d’intérêts.

1 seqname  name of the chromosome or scaffold; chromosome names can be given with or without the 'chr' prefix.
2 source name of the program that generated this feature, or the data source 
3 feature feature type name
4 start Start position of the feature, with sequence numbering starting at 1
5 end End position of the feature, with sequence numbering starting at 1
6 score A floating point value
7 strand One of ".", "+" or "-". "+" when the feature stands on the same strand than the support sequence ("-" for reverse strand)
8 frame One of '0', '1' or '2'. '0' indicates that the first base of the feature is the first base of a codon, '1' that the second base is the first base of a codon, and so on
9 attribute A semicolon-separated list of tag-value pairs, providing additional information about each feature

Fichier GFF

Le fichier pour l'étude, O.tauri_annotation.gff contient les gènes

##gff-version 3
#!gff-spec-version 1.21
#!processor NCBI annotwriter
#!genome-build version 140606
#!genome-build-accession NCBI_Assembly:GCF_000214015.3
#!annotation-source INSDC submitter
##sequence-region NC_014426.2 1 1096037
##species https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi?id=70448
NC_014426.2     RefSeq  gene    244     1932    .       -       .       ID=ostta01g00010
NC_014426.2     RefSeq  gene    2077    4029    .       +       .       ID=ostta01g00020
NC_014426.2     RefSeq  gene    4157    5299    .       +       .       ID=ostta01g00030
NC_014426.2     RefSeq  gene    5392    7041    .       -       .       ID=ostta01g00040
NC_014426.2     RefSeq  gene    7386    9605    .       -       .       ID=ostta01g00050
NC_014426.2     RefSeq  gene    9780    10412   .       -       .       ID=ostta01g00060
NC_014426.2     RefSeq  gene    11358   12455   .       +       .       ID=ostta01g00070
NC_014426.2     RefSeq  gene    12585   12848   .       -       .       ID=ostta01g00080
NC_014426.2     RefSeq  gene    13009   15890   .       +       .       ID=ostta01g00090
NC_014426.2     RefSeq  gene    16094   20050   .       +       .       ID=ostta01g00100
NC_014426.2     RefSeq  gene    20110   20694   .       -       .       ID=ostta01g00110
NC_014426.2     RefSeq  gene    21003   22493   .       +       .       ID=ostta01g00120

Integrative Genomics Viewer

Visualisation des reads alignés sur le génome

ostta18g0198

+ FE

- FE

Différence importante du nombre de reads alignés

gène (gff)

génome (fasta)

mapping (bam)

Worflow d'analyse

Reads (fastq)

Génome de référence

Annotations du génome

FASTQC

Bowtie2

SAMtools

IGV

DEseq2

HTSeq

Comptage, HTseq

ostta01g00010   305
ostta01g00020   156
ostta01g00030   23
ostta01g00040   725
ostta01g00050   500
ostta01g00060   226
ostta01g00070   137
ostta01g00080   22
ostta01g00090   931
ostta01g00100   558
ostta01g00110   5
ostta01g00120   249
ostta01g00130   270
ostta01g00140   916
ostta01g00150   0
ostta01g00160   171
ostta01g00170   35
ostta01g00180   7
ostta01g00190   93
ostta01g00200   50
ostta01g00210   90

Annotations du génome

Fichier GFF

HTSeq

Mapping des reads

Fichier BAM

L’activité transcriptionnelle des gènes est supposée proportionnelle au nombre de séquences observées

Comptage du nombre de reads par gène

6 fois

Worflow d'analyse

Reads (fastq)

Génome de référence

Annotations du génome

FASTQC

Bowtie2

SAMtools

IGV

DEseq2

HTSeq

1 fois

Analyse différentielle, DESeq2

Création d'une table de comptage unique

Analyse différentielle, DESeq2

Obtention d'un logFC et d'une pValue ajustée permettent de sélectionner des gènes à étudier

Le + il y a de répliques dans chaque condition, le + le test statistique est puissant

Analyse différentielle de l'expression des gènes basée sur un modèle statistique

Bilan du workflow

Reads (fastq)

Génome de référence

Annotations du génome

FASTQC

Bowtie2

SAMtools

IGV

DEseq2

HTSeq

@SRR3099585.1 HWI-ST365:427:H8K2HADXX:1:1101:1497:2215/1
CTCCCTTGACATCTCGATGTCCTTGGTGAGCTCGTCAACCGCGTCCGCACGATACATTTGGTATGTCTTGAATACCTTCGGGAATCGTTGACGATCTGGA
+
@@@DADDD8:CFH9E3:?AC?BF>AC<+C+<E?:8C?FEE0?D0@:'--;A?B;>>3(6;@B>5;5B@@A@:3>A#########################
@SRR3099585.2 HWI-ST365:427:H8K2HADXX:1:1101:1653:2087/1
GTCGACGAATATAAAGTTATTGGGAGAGACGCTGAAGGTCGCGTTGGAGATGGACTCAATTGCGCTTCGCGTTCGCCTCGTGGGTGTTCGCCCGGCTCAC
+
@CBFFFFFHHGHHJJJHHJJJJJJJJJIJJJJJJIJJJGHJJJJJJHHHHHFFFFFEEEEEEDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDBDDDDDDDDDDDDDDD
@SRR3099585.3 HWI-ST365:427:H8K2HADXX:1:1101:1554:2142/1
CGACTCAATAACCTTGTCTTCGATCGGCGGCACGGAGCCAGTGATATCGCATTCGCCGGGGAACCACTCGAGCTCAGTCATCCGAGAGCGCAAGGGCGCT
...
>NC_014426.2 Ostreococcus tauri WGS project CAID00000000 data, contig chromosome 01, whole genome shotgun sequence
ccctaaaccctaaaccctaaaccctaaaccctaaaccctaaaccctaaaccctaaaccctaaaccctaaaccctaaaccc
taaaccctaaaccctaaaccctaaaccctaaaccctaaaccctaaaccctaaaccctaaacgaTGCATTACTACTCACAC
GAACGAGTGAATGAAACACACGAAACACAACTATCTGCATGGGAATGCGATGCTTTCTGACGATATGTTACACGATTCGA
GTGTCATCGTCTTTTCAATGACGCTTGCGCTCCGAAaatgctcgcgcgctgagcTACGGACCCTGTTTTGTATTCGACAT
CATCATCCGTTTTTATCGGCGCCGAGCCCTCAAAAacagccgcgcgcgctgtgaTGCTCGGAGAGATATTTTCACCCTTC
GGCAAAGACACTGGGCTCTCGCGTTTGACGAGTTCGGGCTCTCGCATTGCCGCTGTCGCTCCATCTATTTTCACCCTGGT
CGGCTGCGACGGTTTTACGATCGTTACCGCTTGCGGTCTCTCCACGTCGGCTAAATCATccaagtcgtcgtcgatatCGC
TTTCCTCCTCGACCGAGCGATTCCGCCGCGCCACGGCGGCTGCCCACGCATCGTTTGTTTCAACTTCATACGGCGTAACA
GCAGTGACCAACGGTATCGCCGCTGATGGCGGCGTTATAACCTTCTGTGCCGCAGCACGGACGACCGGTGCGCACGCGAC
AGGCTCTTTCACaaccggcggcggcatTTGCGACGCTTTCTTAATCGCGTCCGACTCCCTCGCTTTGAAAACGTTTGACG
CGACTGAAATTGCAGTCGGAACTTCAACATTTGCCTCGTGGTGCGATGAGACATTCGACTGCGAACGAGCCGACGCAGAA
GAGAAGAAATCCGTCTTCGGCGTTAATGACACATCCGCCCCTTTAGCTGATTCTGATTCTGTCACGATTGGTTCAACCTC
TAGGGGAAGATTTGGCACATTAGTCAGCTCTGGATTGTGCGTCGCGTTTTCGTTCAATACGCGCTCGGCTTCGTCAGCGC
TCACACCCGTtagacgctcgagctcggcgagctgTTTGCGAAGCGCCTCCATCTCATCCGCTGTTCCAGCCTCGCCACTC
GAGTCGTTTGTGGACGGAAGCGCATTTCGTTTCAcattcgcgacgccgccctcgAGTACATTTCCTACAAATCGCACTTC
GCGTTCAAAATTTTCTTCGTCGAGGAACTCCTCCTCAAACACTGAAGCTCGCGCgggtcgaggcgctcgctcggTCTCGA
CTCGACGCTCAGCGATCGGCGCTGATGTTGGTGATGGCACAGGAGCCGAACACGTTGTTTGATCCTGCTCATACACCGGC
ACGCTAGCCGGCGCTAAACGCGTCGcatacgcgcgcgaaccttGTTCGTATGCCATTCTCTGTCCACCGAGAGTCTGCTG
cccgccacgcgcgtgcggcgcgtATCCTCCTCTTTCGTCGTACGT...
##gff-version 3								
#!gff-spec-version 1.21								
#!processor NCBI annotwriter								
#!genome-build version 140606								
#!genome-build-accession NCBI_Assembly:GCF_000214015.3								
#!annotation-source INSDC submitter 								
##sequence-region NC_014426.2 1 1096037								
##species https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi?id=70448								
NC_014426.2    RefSeq    gene	244	1932	.	-	.	ID=ostta01g00010
NC_014426.2    RefSeq    gene	2077	4029	.	+	.	ID=ostta01g00020
NC_014426.2    RefSeq    gene	4157	5299	.	+	.	ID=ostta01g00030
...

fastq

fasta

gff

SRR3099585.1  0  NC_014429.2  517050  42  100M  *  0  0  CTCCCTTGACATCTCGATGTCCTTGGTGAGCTCGTCAACCGCGTCCGCACGATACATTTGGTATGTCTTGAATACCTTCGGGAATCGTTGACGATCTGGA  @@@DADDD8:CFH9E3:?AC?BF>AC<+C+<E?:8C?FEE0?D0@:'--;A?B;>>3(6;@B>5;5B@@A@:3>A#########################  AS:i:-6  XN:i:0  XM:i:3  XO:i:0  XG:i:0  NM:i:3  MD:Z:76G5T5G11  YT:Z:UU
SRR3099585.2  0  NC_014431.2   29281  42  100M  *  0  0  GTCGACGAATATAAAGTTATTGGGAGAGACGCTGAAGGTCGCGTTGGAGATGGACTCAATTGCGCTTCGCGTTCGCCTCGTGGGTGTTCGCCCGGCTCAC  @CBFFFFFHHGHHJJJHHJJJJJJJJJIJJJJJJIJJJGHJJJJJJHHHHHFFFFFEEEEEEDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDBDDDDDDDDDDDDDDD  AS:i:-5  XN:i:0  XM:i:1  XO:i:0  XG:i:0  NM:i:1  MD:Z:46A53  YT:Z:UU
SRR3099585.1    0       NC_014429.2     517050  42      100M    *       0       0       CTCCCTTGACATCTCGATGTCCTTGGTGAGCTCGTCAACCGCGTCCGCACGATACATTTGGTATGTCTTGAATACCTTCGGGAATCGTTGACGATCTGGA    @@@DADDD8:CFH9E3:?AC?BF>AC<+C+<E?:8C?FEE0?D0@:'--;A?B;>>3(6;@B>5;5B@@A@:3>A######################### AS:i:-6 XN:i:0  XM:i:3  XO:i:0  XG:i:0  NM:i:3  MD:Z:76G5T5G11  YT:Z:UU
SRR3099585.2    0       NC_014431.2     29281   42      100M    *       0       0       GTCGACGAATATAAAGTTATTGGGAGAGACGCTGAAGGTCGCGTTGGAGATGGACTCAATTGCGCTTCGCGTTCGCCTCGTGGGTGTTCGCCCGGCTCAC    @CBFFFFFHHGHHJJJHHJJJJJJJJJIJJJJJJIJJJGHJJJJJJHHHHHFFFFFEEEEEEDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDBDDDDDDDDDDDDDDD AS:i:-5 XN:i:0  XM:i:1  XO:i:0  XG:i:0  NM:i:1  MD:Z:46A53      YT:Z:UU
SRR3099585.3    16      NC_014440.2     89634   40      100M    *       0       0       AGCGCCCTTGCGCTCTCGGATGACTGAGCTCGAGTGGTTCCCCGGCGAATGCGATATCACTGGCTCCGTGCCGCCGATCGAAGACAAGGTTATTGAGTCG    #####################C@ACC@@988998<8(<50&5'8;5>3@??1C@>;.)..7?5'B;'A8@:D@)??HBC<EA+GHC<?8FHD;DDDD<@@ AS:i:-14        XN:i:0  XM:i:5  XO:i:0  XG:i:0  NM:i:5  MD:Z:36C3T17T4G35T0     YT:Z:UU
SRR3099585.4    16      NC_014427.2     869647  42      100M    *       0       0       GACGTCTCCAGAAGATGTCGGCGGCATGGACGCCGCTGAGGGCATCCTCACCGCGCGCGGCGGCATGACCTCCCACGCCGCCGTCGTCGCGAGAGGCTGG    <<@BABDDDDEDCD@<55B@@5@DDEB>909;85CCABCDCDCDCB?<B8B8799BB<669A@8>C<?B@A@?;D?9AF>>IFIHGA@D@FFDBDDD@@@ AS:i:0  XN:i:0  XM:i:0  XO:i:0  XG:i:0  NM:i:0  MD:Z:100        YT:Z:UU
SRR3099585.5    0       NC_014444.2     80679   42      100M    *       0       0       CCCGGCGTGAAAATCAGTCGTCCAAACAGTGGCGCGCCTCTGTAGCGCCCGTGCCTCGAGGTCATACACGCTCGTAGAGTTGAAATCACTCGTCTTTGTC    ?@?ADDDDHHDFH>FH?2CF?CDGIIIH@BBBD6DFAHGIICFH?><BDCC9;?AA5;=@B7?@CDCCC?BBB;>B<?C:>AACCCCAC@@@<?<@C>4> AS:i:0  XN:i:0  XM:i:0  XO:i:0  XG:i:0  NM:i:0  MD:Z:100        YT:Z:UU
SRR3099585.6    16      NC_014435.2     136707  42      100M    *       0       0       GAGCTCGTGCGCACCGCCGCCCCCCCGCCGAGATCACCGGCGGAGACTGCGGAGAAGTTGCAATTGCTCCAGGACAGCGGGATGATTTTGGTGCTCGAGG    ######################D@DDDDDDDDC?B@DDFFHGHDIIIHGJJHJJJJIJJIGIGJIGCCIIGIIHJJIGHJIIJJIJIHHFFHFDDDD?== AS:i:-8 XN:i:0  XM:i:4  XO:i:0  XG:i:0  NM:i:4  MD:Z:13A1A0G4T78        YT:Z:UU
ostta01g00010   305
ostta01g00020   156
ostta01g00030   23
ostta01g00040   725
ostta01g00050   500
ostta01g00060   226
ostta01g00070   137
ostta01g00080   22
ostta01g00090   931
...

tri

6

6 fois

1

1

6 fois

6 fois

6 fois

1 fois

6 fois

6 fois

Etape 1

Installation du premier outil, FastQC

Navigateur : FastQC

 

  

https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/download.html

Décompresser le fichier téléchargé

et lire la documentation

Ouvrir un terminal

Installation de FastQC

 

  

Aller avec un cd jusqu'au fichier décompressé

puis

tdenecker@DESKTOP-B8ON598:fastqc_v0.11.8/FastQC$ ./fastqc
Can't exec "java": No such file or directory at ./fastqc line 283.

Installation de java

 

  

Problématiques

 

  

  • Installation de java (pas toujours simple surtout pour linux)
  • Utilisation de fastqc
  • Mise à jour de fastqc

 

Installation plus simple?

Etape 2

Installation automatique,

conda

Gestionnaire de paquets et d'environnements open source

    - Installation des paquets

    - Exécution des paquets

    - Mise à jour des paquets

 

Multi-plateforme :  Windows, macOS et Linux

 

Pas de problèmes de compilation, de dépendances,..., Conda se charge de tout !

Il existe des canaux de diffusion dans Conda

 

Bioconda est un canal de diffusion de logiciels, utilisable par le gestionnaire de paquets conda et proposant de nombreux logiciels utilisés en bioinformatique.

 

Tous les outils linux utilisés dans ce projet sont sur bioconda

Installation de Fastqc par Conda

# Téléchargement
wget --quiet https://repo.anaconda.com/miniconda/Miniconda3-latest-Linux-x86_64.sh

# Installation 
bash Miniconda3-latest-Linux-x86_64.sh -b

# Suppression du fichier téléchargé
rm Miniconda3-latest-Linux-x86_64.sh

Téléchargement de miniconda

Version légère de conda

Ajout du chemin dans le path

Pour utiliser la commande conda directement 

export PATH=~/miniconda3/bin:$PATH

Mise à jour de conda

 

Installation de Fastqc par Conda

## Update
conda update conda
conda update --all

Ajout des canaux de diffusion

 

## Add channels
conda config --add channels conda-forge
conda config --add channels bioconda

Installation de fastqc

conda install -y fastqc

L'installation de java a été réalisée par conda (dépendance) 

Et voilà ! 

Et voilà ! 

Pas si simple !

Beaucoup de commandes !

L'autre méthode est plus facile

Mais c'est vrai pour fastQC

Mais maintenant pour les autres 

conda install -y bowtie2 htseq samtools

Mais c'est vrai pour fastQC

Mais maintenant pour les autres 

conda install -y bowtie2 htseq samtools

et c'est tout!  

Script complet d'installation

# Installation - conda 
wget --quiet https://repo.anaconda.com/miniconda/Miniconda3-latest-Linux-x86_64.sh
bash Miniconda3-latest-Linux-x86_64.sh -b
rm Miniconda3-latest-Linux-x86_64.sh

## Add in path
export PATH=~/miniconda3/bin:$PATH

## Update
conda update conda
conda update --all

## Add chanel
conda config --add channels conda-forge
conda config --add channels bioconda

## Install fastqc, bowtie2, htseq and samtools
conda install -y fastqc bowtie2 htseq samtools

Etape 3

Rappel : Automatisation du téléchargement

Script en fin de session 2

##------------------------------------------------------------------------------
## FAIR script
## Author: T. Denecker & C. Toffano-Nioche
## Affiliation: I2BC
## Aim: A workflow to process RNA-Seq.
## Organism: O. tauri
## Date: Jan 2019
## Step :
## 1- Create tree structure
## 2- Download data from SRA
##------------------------------------------------------------------------------

echo "=============================================================="
echo "Creation of tree structure"
echo "=============================================================="

mkdir Project
mkdir Project/samples
mkdir Project/annotations
mkdir Project/bowtie2
mkdir Project/fastqc
mkdir Project/genome
mkdir Project/graphics
mkdir Project/htseq
mkdir Project/reference
mkdir Project/samtools

echo "=============================================================="
echo "Download data from SRA"
echo "=============================================================="

cd Project/samples

IFS=$'\n'       # make newlines the only separator
for j in $(tail -n +2 ../../conditions.txt)
do
    
    # Get important information from the line
    access=$( echo "${j}" | cut -f6 )
    id=$( echo "${j}" | cut -f1 )
    md5=$( echo "${j}" | cut -f7 )

    echo "--------------------------------------------------------------"
    echo ${id}
    echo "--------------------------------------------------------------"

    # Download file
    wget ${access} # wget method

    # Get md5 of downloaded file
    md5_local="$(md5sum ${id}.fastq.gz | cut -d' ' -f1)"
    echo ${md5_local}
    
    # Test md5 
    if [ "${md5_local}" == "${md5}" ]
    then
        echo "Done"
    else
        echo "Nope"
        exit 1
    fi
done

cd ../..
exit 0

Retour sur la boucle 

Faire répéter à l'ordinateur la même chose mais avec des valeurs différentes

Retour sur la boucle 

Nous souhaitons faire la même action pour toutes les lignes du fichier "conditions.txt"

- 1ère col. pour la variable "id"

- 6ème colonne pour la variable "access"

- 7ème col. pour la variable "md5"

Retour sur la boucle 

for j in $(tail -n +2 ../../conditions.txt)
do
    [...]
done

En Unix pour lire ligne par ligne : 

Le contenu de la ligne est stocké dans une variable nommée j

Pour chaque ligne de conditions.txt 

access=$( echo "${j}" | cut -f6 )

1- Récupérer l'adresse wget, l'identifiant et le md5 de la ligne j

Si nous décomposons la commande en français :

  1. Accès du contenu de la ligne (variable) : ${j}
  2. Affichage du contenu de la ligne sous forme de chaîne de caractères : echo "${j}"
  3. Sur cette chaîne de caractères, nous allons appliquer une autre commande : |
  4. Nous sélectionnons le contenu de la colonne 6 : cut -f6
  5. Nous stockons le tout dans une nouvelle variable : =$( )

Pour chaque ligne de conditions.txt 

access=$( echo "${j}" | cut -f6 )

1- Récupérer l'adresse wget, l'identifiant et le md5 de la ligne j

Si nous décomposons la commande en français :

  1. Accès du contenu de la ligne (variable) : ${j}
  2. Affichage du contenu de la ligne sous forme de chaîne de caractères : echo "${j}"
  3. Sur cette chaîne de caractères, nous allons appliquer une autre commande : |
  4. Nous sélectionnons le contenu de la colonne 6 : cut -f6
  5. Nous stockons le tout dans une nouvelle variable : =$( )

Principe réalisé 3 fois en changeant de colonne :

access=$( echo "${j}" | cut -f6 )
id=$( echo "${j}" | cut -f1 )
md5=$( echo "${j}" | cut -f7 )

Pour chaque ligne de conditions.txt 

2- Télécharger le fichier

wget ${access}

3- Calcul et affichage du md5 du fichier téléchargé

md5_local="$(md5sum ${id}.fastq.gz | cut -d' ' -f1)"
echo ${md5_local}

Rappel : ${access} permet d'accéder au contenu de la variable "access"

A vous !

Pour chaque ligne de conditions.txt 

4- Tester si les 2 md5 (le local et l'espéré) sont identiques : l'original

 

 

if [ "${md5_local}" == "${md5}" ]
then
    echo "Done"
else
    echo "Nope"
    exit 1
fi

==   test d'égalité                     !=   test d'inégalité

En français

Si le md5 présent dans le fichier conditions.txt est égal au md5 du fichier téléchargé

alors afficher "Done" 

sinon afficher "Nope" et quitter avec une erreur 1

Et nous recommençons pour chaque ligne de conditions.txt

Téléchargement du génome et du fichier d'annotation 

echo "=============================================================="
echo "Download annotations"
echo "=============================================================="

wget https://raw.githubusercontent.com/thomasdenecker/FAIR_Bioinfo/master/Data/O.tauri_annotation.gff -P Project/annotations

echo "=============================================================="
echo "Download genome"
echo "=============================================================="

wget https://raw.githubusercontent.com/thomasdenecker/FAIR_Bioinfo/master/Data/O.tauri_genome.fna -P Project/genome

Stockage dans les dossiers précédemment créés

Architecture à la fin de la session 2

tdenecker@DESKTOP-B8ON598:~/Fair_project$ tree Project/
Project/
├── annotations
│   └── O.tauri_annotation.gff
├── bowtie2
├── fastqc
├── genome
│   └── O.tauri_genome.fna
├── graphics
├── htseq
├── reference
├── samples
│   ├── SRR3099585.fastq.gz
│   ├── SRR3099586.fastq.gz
│   ├── SRR3099587.fastq.gz
│   ├── SRR3105697.fastq.gz
│   ├── SRR3105698.fastq.gz
│   └── SRR3105699.fastq.gz
└── samtools

Etape 4

Script du workflow d'analyse

Avec un échantillon

# Nom du fichier sans le .fastq.gz
sample="SRR3099585"
# nom du fichier contenant le génome de référence
genome="./Project/genome/O.tauri_genome.fna"
# nom du fichier contenant les annotations
annotations="./Project/annotations/O.tauri_annotation.gff"

echo "=============================================================="
echo "Contrôle qualité - échantillon ${sample}"
echo "=============================================================="
fastqc Project/samples/${sample}.fastq.gz --outdir Project/fastqc/

echo "=============================================================="
echo "Indexation du génome de référence"
echo "=============================================================="
bowtie2-build ${genome} O_tauri

echo "=============================================================="
echo "Alignement des reads sur le génome de référence - échantillon ${sample}"
echo "=============================================================="
bowtie2 -x O_tauri -U Project/samples/${sample}.fastq.gz -S Project/bowtie2/bowtie-${sample}.sam 2> Project/bowtie2/bowtie-${sample}.out

echo "=============================================================="
echo "Conversion en binaire, tri et indexation des reads alignés - échantillon ${sample}"
echo "=============================================================="
samtools view -b Project/bowtie2/bowtie-${sample}.sam > Project/samtools/bowtie-${sample}.bam
samtools sort Project/samtools/bowtie-${sample}.bam -o Project/samtools/bowtie-${sample}.sorted.bam
samtools index Project/samtools/bowtie-${sample}.sorted.bam

echo "=============================================================="
echo "Comptage - échantillon ${sample}"
echo "=============================================================="
htseq-count --stranded=no --type='gene' --idattr='ID' --order=name --format=bam Project/samtools/bowtie-${sample}.sorted.bam ${annotations} > Project/htseq/count-${sample}.txt

echo "=============================================================="
echo "Nettoyage des fichiers inutiles - échantillon ${sample}"
echo "=============================================================="
rm -f Project/samtools/bowtie-${sample}.sam Project/bowtie2/bowtie-${sample}.bam

Et maintenant ?

Pour plusieurs échantillons 

# Liste des fichiers fastq.gz à analyser
dirlist=$(find Project/samples/*.fastq.gz)
# nom du fichier contenant le génome de référence
genome="./Project/genome/O.tauri_genome.fna"
# nom du fichier contenant les annotations
annotations="./Project/annotations/O.tauri_annotation.gff"

for file in ${dirlist}
do
    # Name without path
    file_name="$(basename $file)"
    # Name without path and .gz
    nameFastq="${file_name%.*}"
    # Name without path, .gz and fastq
    sample="${nameFastq%.*}"

    echo "====================================================================="
    echo "Contrôle qualité - échantillon ${sample}"
    echo "====================================================================="
    fastqc Project/samples/${sample}.fastq.gz --outdir Project/fastqc/

    echo "====================================================================="
    echo "Indexation du génome de référence"
    echo "====================================================================="
    bowtie2-build ${genome} O_tauri

    echo "====================================================================="
    echo "Alignement des reads sur le génome de référence - échantillon ${sample}"
    echo "====================================================================="
    bowtie2 -x O_tauri -U Project/samples/${sample}.fastq.gz -S Project/bowtie2/bowtie-${sample}.sam 2> Project/bowtie2/bowtie-${sample}.out

    echo "====================================================================="
    echo "Conversion en binaire, tri et indexation des reads alignés - échantillon ${sample}"
    echo "====================================================================="
    samtools view -b Project/bowtie2/bowtie-${sample}.sam > Project/samtools/bowtie-${sample}.bam
    samtools sort Project/samtools/bowtie-${sample}.bam -o Project/samtools/bowtie-${sample}.sorted.bam
    samtools index Project/samtools/bowtie-${sample}.sorted.bam

    echo "====================================================================="
    echo "Comptage - échantillon ${sample}"
    echo "====================================================================="
    htseq-count --stranded=no --type='gene' --idattr='ID' --order=name --format=bam Project/samtools/bowtie-${sample}.sorted.bam ${annotations} > Project/htseq/count-${sample}.txt

    echo "=============================================================="
    echo "Nettoyage des fichiers inutiles - échantillon ${sample}"
    echo "=============================================================="
    rm -f Project/samtools/bowtie-${sample}.sam Project/bowtie2/bowtie-${sample}.bam

done

Différences pour le multiple

# Liste des fichiers fastq.gz à analyser
dirlist=$(find Project/samples/*.fastq.gz)

[...]

for file in ${dirlist}
do
    # Name without path
    file_name="$(basename $file)"
    # Name without path and .gz
    nameFastq="${file_name%.*}"
    # Name without path, .gz and fastq
    sample="${nameFastq%.*}"
    [...]

done

1- Récupération de la liste des fichiers

2- Pour chaque fichier, préparation de la variable "sample"  :

     1- retrait du chemin d'accès

     2- retrait des extensions

Et le reste?

Il n'y a aucun changement car nous utilisons les mêmes variables

 

Intérêt :

- pas beaucoup de changements pour lancer sur tous les fichiers RNAseq

- Nous n'avons plus qu'à attendre la fin

Et le reste?

Il n'y a aucun changement car nous utilisons les mêmes variables

 

Intérêt :

- pas beaucoup de changements pour lancer sur tous les fichiers RNAseq

- Nous n'avons plus qu'à attendre la fin... et c'est long

L'arborescence

Attention

Projet pèse 15 Go maintenant !

Project/
├── annotations
│   └── O.tauri_annotation.gff
├── bowtie2
│   ├── bowtie-.out
│   ├── bowtie-SRR3099585.out
│   ├── bowtie-SRR3099585.sam
│   ├── bowtie-SRR3099586.out
│   ├── ...
│   └── bowtie-SRR3105699.sam
├── fastqc
│   ├── SRR3099585_fastqc.html
│   ├── SRR3099585_fastqc.zip
│   ├── ...
│   └── SRR3105699_fastqc.zip
├── genome
│   └── O.tauri_genome.fna
├── graphics
├── htseq
│   ├── count-SRR3099585.txt
│   ├── count-SRR3099586.txt
│   ├── ...
│   └── count-SRR3105699.txt
├── reference
├── samples
│   ├── SRR3099585.fastq.gz
│   ├── SRR3099585_fastqc.html
│   ├── SRR3099585_fastqc.zip
│   ├── SRR3099586.fastq.gz
│   ├── ...
│   └── SRR3105699_fastqc.zip
└── samtools
    ├── bowtie-SRR3099585.bam
    ├── bowtie-SRR3099585.sorted.bam
    ├── bowtie-SRR3099585.sorted.bam.bai
    ├── bowtie-SRR3099586.bam
    ├── ...
    └── bowtie-SRR3105699.sorted.bam.bai

9 directories, 69 files

Et maintenant ?

Conclusion

 

Bilan de la session

Création d'un script d'analyse complet et automatique :

- Lancement de l'ensemble des outils d'analyse

- Organisation des fichiers de sortie

 

Savoir FAIRe

- Utilisation de Conda

- Un script d'installation des outils

- Un script de worflow pour l'analyse

 

Pour la prochaine fois

Reproduire la session 3 (si pas fait lors de la session) :

  • Utiliser le script et avoir les 6 tables de comptage
  • Un github à jour 

Bon courage !

RDV sur Slack en cas de problème